Рис. 1: Схема эксперимента по получению гибридных клеток P19/МЦ×PCC4aza1.

Рис. 2: Морфология клеток линии P19 (A) и линии PCC4aza1 (B).

Рис. 3: Гибридный клон P19/МЦ×PCC4aza1.

Рис. 4: Морфология клеток полиплоидного гибридного клона P19/Р6G x PCC4aza1 (светлые клетки), выросшего рядом с гетерокарионом, получившимся в результате слияния между собой нескольких клеток P19/Р6G (показан стрелкой)

ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК С РЕПЛИКАТИВНО ИНАКТИВИРОВАННЫМ ГЕНЕТИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛОМ

ОДНОГО ИЗ ПАРТНЕРОВ ПО СЛИЯНИЮ \underline{Е.И. Филясова} , О.В. Зацепина, О.А. Ларионов, Ю.М. Ходарович

Институт Биоорганической Химии им. академиков Шемякина М.М. и Овчинникова Ю.А. РАН, Москва

Гибридные клетки с репликативно инактивированным генетическим материалом одного из партнеров по слиянию могут быть использованы для изучения влияния ядерноцитоплазматических факторов одной клетки на состояние дифференцировки другой клетки. Также такие гибридные клетки могут найти применение в клеточной терапии, так как позволяют получить клетки с диплоидным набором хромосом, аутологичные клеткам пациента.

Для репликативной инактивации ДНК одного из партнёров по слиянию использовали ДНК-сшивающий агент митомицин Ц (МЦ) (рис. 1). Работу проводили на клетках эмбриональной карциномы мыши линий P19 и PCC4aza1 (рис. 2). Было показано, что обработка клеток P19 МЦ не препятствует образованию жизнеспособных гибридов с интактными клетками PCC4aza1 (рис. 3). Процент выросших колоний после проведения слияния был довольно высоким: 1 колония на 10^{4} подвергающихся слиянию клеток PCC4aza1. Обработка МЦ существенно не влияет на эффективность образования гибридов. Это было продемонстрировано при получении полиплоидных гибридов между клетками PCC4aza1 и клетками P19, обработанными токсическим митохондриальным красителем родамином 6G (Р6G) (рис. 4). Полиплоидные гибридные клетки были получены в условиях, сходных с условиями получения гибридных клеток P19/МЦ×PCC4aza1.

Эффективность получения клонов полиплоидных клеток составляла 2.5 колонии на 10^{4} клеток PCC4aza1. Стоит отметить, что при получении тетраплоидных гибридов между клетками PCC4aza1 и соматическими клетками (спленоцитами) эффективность образования гибридных клонов резко падала и составляла 1 клон на 5 × 10^{6} клеток PCC4aza1.

Хромосомный анализ гибридных клеток P19/МЦ×PCC4aza1 показал наличие в них хромосом клеток PCC4aza1 (рис. 5). Микросателлитный ПЦР анализ на маркеры хромосом 5, 6, 8 и 14 показал, что микросателлиты гибридных клонов в точности совпадают с микросателлитами клеток PCC4aza1 (рис. 6). Названия используемых микросателлитных маркеров и последовательности праймеров приведены в таблице 1. Также был проведен анализ состава митохондриальной ДНК полученных гибридных клонов с помощью аллель-специфичной ПЦР. На (рис. 7) приведены результаты ПЦР, указаны последовательности праймеров и условия реакции. Приведенные данные также говорят о том, что в потомках гибридных клеток содержится генетический материал только одного из партнёров по слиянию (PCC4aza1).

Выводы

1.При слиянии клеток, обработанных МЦ, с интактными клетками удается получить жизнеспособные гибриды.

2.В гибридных клетках отсутствует геномная и митохондриальная ДНК клеток, обработанных МЦ.

3.Число хромосом в гибридных клетках соответствует числу хромосом клеток PCC4aza1 и свидетельствует об отсутствии в них хромосом клеток Р19.

Рис. 5: Хромосомный анализ клеток линии P19 (A), клеток линии PCC4aza1 (B) и гибридных клеток P19/МЦ×PCC4aza1 (C).

Рис. 6: Микросателлитный ПЦР-анализ с использованием маркеров D6Mit102 и Mt3pA. 1-5 — ДНК гибридных клонов P19/МЦ×PCC4aza1, PCC4aza1 и P19 соответствуют ДНК исходных линий PCC4aza1 и P19.

Микро-  Размер
сателлитный  ПЦР–фрагмента
маркер Праймеры для линии C3H/He
(хромосома)  и линии 129/Ola

соответственно, п. о.

D5Mit138 (5) Пр. 5′-AGACAGTTACCTTCTTCCCAAGG-3′  120 и 142
Обр. 5′-TGTTTCTCCCTTCTGCCATC-3′
D6Mit102 (6) Пр. 5′-CCATGTGGATATCTTCCCTTG-3′  125 и 177
Обр. 5′-GTATACCCAGTTGTAAATCTTGTGTG-3′
Mt3-pA (8) Пр. 5′-CCCCTTTCTAGCCTTCTTCA-3′ 123 и 162
Обр. 5′-TTTGGTCCAAACGGGATGCT-3′
D8Mit4 (8) Пр. 5′-CCAACTCATCCCCAAAGGTA-3′ 195 и 175
Обр. 5′-GTATGTTCAAGGCTGGGCAT-3′
D14Mit92 (14) Пр. 5′-CTGCTGCAGAATTAATTGATTTT-3′  122 и 88
Обр. 5′-GGATATATGGATTTATACAGACACACA-3′

Таблица 1. Структура праймеров, используемых для микросателлитного анализа гибридных клеток P19/МЦ×PCC4aza1 и клеток исходных линий P19 (мышь линии C3H/He) и PCC4aza1 (мышь линии 129/Ola).

Рис. 7: Анализ наследования митохондрий в гибридных клонах P19/МЦ×PCC4aza1. Вверху – ПЦР, специфичная для линии C3H/He (праймеры MitF1-MitR1), внизу – ПЦР, специфичная для линии 129/Ola (праймеры MitF2-MitR1). 1-5 – ДНК гибридных клонов P19/МЦ×PCC4aza1, PCC4aza1 и P19 соответствуют ДНК исходных линий PCC4aza1 и P19.

Последовательности праймеров:

MitF1 5′-ATACTGACATTTTGTAGACGTAA-3′Tотж = 61^{∘}C
MitF2 5′-ATACTGACATTTTGTAGACGTAG-3′Tотж = 58^{∘}C
MitR1 5′-GTAGAAGAGCAATTTCTAGGTC-3′